支原體污染一直是細(xì)胞生物學(xué)研究面臨的主要問題之一，因?yàn)樗鼈儠绊懟蚋淖兗?xì)胞的生理機(jī)能。由于其寄生特性和適應(yīng)宿主細(xì)胞的能力，支原體經(jīng)常作為污染物出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中。 [1]
支原體沒有細(xì)胞壁。出于這個原因，它們對靶向細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素（例如pen/strep）不敏感，這些抗生素通常用于細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞壁的缺乏以及它們的小尺寸（通常為 0.2 - 0.3 ?m）也使它們在傳統(tǒng)顯微鏡下的檢測變得復(fù)雜。它們的小尺寸和非常靈活的形式也意味著支原體不能通過無菌過濾從液體介質(zhì)中去除。
由于缺乏宏觀效應(yīng)，支原體可能長期未被發(fā)現(xiàn)。特別是在使用標(biāo)準(zhǔn)抗生素的日常工作中，實(shí)驗(yàn)室工作人員的支原體污染可能會在很長一段時間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠渌?xì)菌的污染通過添加抗生素而被選擇性抑制，而同時引入的支原體可以不受阻礙地繁殖。
鑒于此，許多研究表明細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染水平高達(dá) 40% 也就不足為奇了。這些高污染水平的一個可能原因被認(rèn)為是由實(shí)驗(yàn)室工作人員、血清或胰蛋白酶、外來細(xì)胞培養(yǎng)物（交叉污染）或最終由收獲細(xì)胞培養(yǎng)物的動物引入的。 [3]
文獻(xiàn)：
1. HG Drexler, C. Uphoff；Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. 照片：M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer：“Zell- und Gewebekultur"；Gustav Fischer 出版社，斯圖加特 (1987)；RJ Hay、ML Macy、TR Chen；Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]
由于污染的存在會影響從細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的結(jié)果的準(zhǔn)確性，或者在最壞的情況下，會損害細(xì)胞生長到整個培養(yǎng)物丟失的程度，因此必須定期檢查細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在支原體污染。特別是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中必須排除支原體污染，因?yàn)槲廴緦?xì)胞生長和代謝的負(fù)面影響會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率急劇下降。
支原體是軟體菌類中的幾個細(xì)菌屬之一。軟體動物是人類、動物和植物的微小寄生蟲或共生體；根據(jù)定義，支原體屬的 100 多種*物種僅限于脊椎動物宿主，在那里它們被稱為許多疾病的病原體（例如由肺炎支原體引起的肺炎）。
細(xì)胞表面支原體菌落的電子顯微鏡圖像 [2]
支原體細(xì)胞非常小，沒有細(xì)胞壁。因此，它們不受靶向細(xì)胞壁合成的抗生素的影響。支原體的基因組大小范圍為 0.58 – 1.38 兆堿基對，GC 含量低 (18 – 40 mol%)，是所有具有自動復(fù)制能力的原核生物中最小的。
作為需氧或兼性厭氧生物，支原體與其宿主理想地對齊，因此因此在細(xì)胞培養(yǎng)物 (37°C) 中找到最佳生長條件。
...損害細(xì)胞生長
...降低宿主細(xì)胞的代謝活性
...調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生
...在體外誘導(dǎo)染色體畸變
...通過標(biāo)準(zhǔn)無菌過濾器
...對抗生素如青霉素或鏈霉素具有抗性通常用于細(xì)胞培養(yǎng)
...耐高溫和脫水
...影響轉(zhuǎn)染效率
支原體可以在幾乎所有已知的細(xì)胞類型中增殖，因此無處不在。據(jù)估計(jì)，大約 80% 的日本細(xì)胞培養(yǎng)物、65% 的阿根廷細(xì)胞培養(yǎng)物和 15% 的美國細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染。該圖顯示了支原體污染對 HeLa 細(xì)胞生長的廣泛影響。
由于支原體污染具有不可見且不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的特殊特性，因此污染可能會在很長一段時間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)。然而，這些細(xì)菌對轉(zhuǎn)染成功有廣泛的影響：
• 由于精氨酸需求增加，細(xì)胞生長顯著減少
• 支原體調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生
• 支原體導(dǎo)致染色體畸變
• 支原體滯留在細(xì)胞膜中，并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞膜過程，例如內(nèi)吞作用。
所有這些操縱的生理過程也參與轉(zhuǎn)染過程。該圖顯示了支原體污染對 HeLa 和 HepG2 細(xì)胞的廣泛影響：與未污染細(xì)胞相比，效率分別提高了 17% 和 5.6%。
在 48 孔板上用 pCMV?gal 轉(zhuǎn)染 HeLa 和 HepG2 細(xì)胞。通過 ONPG 和 BCA 分析評估比吸收值。左邊的條形顯示由支原體污染導(dǎo)致的轉(zhuǎn)染效率大大降低。
DAPI染色
在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測支原體的一個流行應(yīng)用是用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色細(xì)胞。DAPI 強(qiáng)烈嵌入 DNA 的小溝中，并在紫外線激發(fā)下在最大 460 nm 處顯示出相對較寬的熒光發(fā)射。在無支原體細(xì)胞培養(yǎng)中，僅標(biāo)記細(xì)胞核。如果存在支原體細(xì)胞，它們的 DNA 也會被標(biāo)記。由于它們的體積小，單個支原體細(xì)胞無法在熒光顯微鏡下分辨：只有高度污染會導(dǎo)致可見的模糊面紗形成，這可能無法清楚地識別。
聚合酶鏈反應(yīng)
更靈敏的支原體檢測方法是 PCR。可以在非常早期的污染和低濃度狀態(tài)下檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體。這種檢測方法通常適用于細(xì)胞培養(yǎng)工作。
其他
雖然 ELISA 測試經(jīng)常用于支原體的常規(guī)檢測，但這種方法在靈敏度和特異性方面并不優(yōu)于 DAPI 測試。另一種方法是電子顯微鏡，然而，它需要先進(jìn)的設(shè)備并且更耗時。
結(jié)論
為確保細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體污染引起的諸多問題最終成為過去，Biontex 提供了一系列基于 PCR 的檢測支原體檢測試劑盒：
MycoSPY®（常規(guī) PCR 檢測試劑盒）
MycoSPY® Master Mix（ PCR 檢測試劑盒，包括 Master Mix 和用于凝膠電泳的上樣緩沖液和示蹤染料
該產(chǎn)品對已建立的細(xì)胞系和原代細(xì)胞均取得了優(yōu)異的結(jié)果。
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用 DAPI 染色的 Cos7 細(xì)胞，無 | DAPI 染色未能揭示 |
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當(dāng)存在* 水平的支原體污染時，這些 DAPI 染色的 H441-Luc 細(xì)胞僅在細(xì)胞外圍 | 所有這三種 |
| 方法 | DAPI-測試 | 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) | MycoSPY® | 電子顯微鏡 |
|---|---|---|---|---|
| 努力 | + | + | + | -- |
| 費(fèi)用 | ++ | 0 | + | -- |
| 靈敏度 | -- | - | ++ | + |
| 全部的 | + | 0 | ++++ | --－ |
對于被細(xì)菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)物的處理，通常使用標(biāo)準(zhǔn)抗生素。但是作用于細(xì)胞壁的抗生素（如青霉素）對支原體無效。
因此，我們提供產(chǎn)品MycoRAZOR®，這是一種抗生素混合物，可損害蛋白質(zhì)生物合成（轉(zhuǎn)錄和翻譯）。
