bmgrp BI-VAN1MR說(shuō)明書(shū)
Vanin-1 ELISA Kit (Mouse/Rat VNN1) | BI-VAN1MR
Biomedica大鼠和小鼠Vanin1 ELISA試劑盒：
分析特征
方法
夾心ELISA，HRP / TMB，12×8孔可分離試紙
樣品類型
血清，血漿和尿液
樣品量
5微升/孔
測(cè)定時(shí)間
4小時(shí)/ 30分鐘
靈敏度
2.31 pmol /升
標(biāo)準(zhǔn)范圍
0 – 200 pmol / l（= 0 – 10.6 ng / ml）
轉(zhuǎn)換系數(shù)
1 pmol / l = 52.07 pg / ml（MW：52.07 kDa）
中間運(yùn)行（n = 5）：≤8％CV
批量分析（n = 7）：≤8％CV
特異性
內(nèi)源和重組小鼠/大鼠Vanin-1。
采用
僅供研究使用。
驗(yàn)證數(shù)據(jù)
請(qǐng)參閱驗(yàn)證數(shù)據(jù)選項(xiàng)卡，以了解：精度，準(zhǔn)確性，稀釋線性，樣品值
Vanin-1 ELISA試劑盒是一個(gè)4.5小時(shí)的96孔夾心ELISA，用于定量測(cè)定血清，血漿和尿液中的Vanin-1。
Vanin-1小鼠/大鼠ELISA試劑盒是一種夾心酶免疫測(cè)定法，用于定量測(cè)定小鼠或大鼠樣品中的Vanin-1。該試劑盒利用重組小鼠Vanin-1作為校準(zhǔn)物。VNN1基因在黑猩猩，恒河猴，狗，牛，小鼠，大鼠和雞中是保守的https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/32130。
下圖說(shuō)明了Vanin-1夾心ELISA的原理：
靶抗原： 小鼠/大鼠Vanin-1
靶抗原：重組小鼠Vanin-1
一步，將測(cè)定緩沖液吸移到微量滴定條的孔中。此后，將標(biāo)準(zhǔn)/對(duì)照/樣品和檢測(cè)抗體（多克隆綿羊抗小鼠Vanin-1-HRPO）移入孔中，并預(yù)先涂有抗小鼠Vanin-1抗體。存在于標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品/樣品中的Vanin-1與孔中預(yù)包被的抗體結(jié)合，并與檢測(cè)抗體形成三明治。在洗滌步驟中，將除去所有非特異性未結(jié)合的材料。在下一步中，將底物（TMB，四甲基聯(lián)苯胺）移入孔中。底物的酶催化顏色變化與樣品中Vanin-1的量成正比。使用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀可以檢測(cè)到這種顏色變化。吸光度的劑量響應(yīng)曲線（光密度，使用從標(biāo)準(zhǔn)品獲得的值，生成相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度的450 nm處的OD。直接從劑量響應(yīng)曲線確定樣品中Vanin-1的濃度。
下圖顯示了Mouse Vanin-1 ELISA和Rat Vanin-1 ELISA的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線。Vanin ELISA試劑盒針對(duì)重組小鼠Vanin-1肽進(jìn)行了校準(zhǔn)：
內(nèi)容 | 描述 | 數(shù)量 |
盤子 | 裝在帶干燥劑的鋁袋中的帶固定器中的抗小鼠Vanin-1抗體預(yù)包被的微量滴定條 | 12 x 8測(cè)試 |
洗車場(chǎng) | 洗滌濃縮液20倍 | 1 x 50毫升 |
性病 | 包含重組Mouse Vanin-1（凍干）的儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液（200 pmol / l） | 1個(gè)小瓶 |
CTRL鍵 | 對(duì)照，凍干，濃度見(jiàn)標(biāo)簽 | 1個(gè)小瓶 |
ASYBUF | 測(cè)定緩沖液，準(zhǔn)備使用 | 1 x 7毫升 |
康杰 | 共軛多克隆綿羊抗小鼠Vanin-1抗體-HRP | 1 x 6毫升 |
潛艇 | 基材（TMB解決方案），可以立即使用 | 1 x 13毫升 |
停 | 停止解決方案，準(zhǔn)備使用 | 1 x 7毫升 |
儲(chǔ)存說(shuō)明： Vanin-1 Mouse / Rat ELISA試劑盒中的所有試劑在4°C穩(wěn)定，直到每種試劑標(biāo)簽上注明的有效期。
血清，血漿和尿液樣本適用于此Vanin-1 ELISA分析。研究期間請(qǐng)勿更改樣品類型。我們建議對(duì)所有樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。列出的所列樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般準(zhǔn)則。
使用EDTA，肝素或檸檬酸鹽作為抗凝劑，在標(biāo)準(zhǔn)化血清分離管（SST）或標(biāo)準(zhǔn)化血液采集管中收集靜脈血樣。對(duì)于血清樣品，讓樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘。根據(jù)試管制造商的使用說(shuō)明離心分離。立即測(cè)定采集的樣品，或等分試樣并保存在-25°C或更低的溫度下。脂血或溶血的樣品可能會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。樣品至少要經(jīng)歷4次凍融循環(huán)。
無(wú)菌收集當(dāng)天的一批尿（中游），直接排入無(wú)菌容器中。離心除去顆粒物，立即分析或等分并保存在-25°C或更低的溫度下。樣品可以經(jīng)歷至少四個(gè)凍融循環(huán)。
1。 | 使WASHBUF濃縮液達(dá)到室溫。緩沖液濃縮物中的晶體在室溫下會(huì)溶解。 |
2。 | 將WASHBUF濃縮液按1:20的比例稀釋，例如50 ml WASHBUF + 950 ml蒸餾水或去離子水。進(jìn)行測(cè)定時(shí)僅使用稀釋的WASHBUF。 |
稀釋的WASHBUF在4°C（2-8°C）下可以穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月。
1。 | 移取200 µl蒸餾水或去離子水到儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液（STOCK STD）和對(duì)照（CTRL）小瓶中。準(zhǔn)確的濃度印在每個(gè)樣品瓶的標(biāo)簽上。 |
2。 | 在室溫（18-26°C）下放置10分鐘。輕輕渦旋。 |
重構(gòu)的STD和CTRL在室溫（18-26°C）下穩(wěn)定三個(gè)小時(shí)。STD和CTRL在標(biāo)簽上注明的失效日期之前可穩(wěn)定在-25°C或更低的溫度，并且多可進(jìn)行三個(gè)凍融循環(huán)。
1。 | 使用聚丙烯管，并將它們標(biāo)記為STD6至STD1，如下所示（圖1）。 |
2。 | 將STOCK STD標(biāo)記為STD7。 |
3。 | 吸取50 µl ASYBUF（測(cè)定緩沖液）到每個(gè)標(biāo)有STD6至STD1的管中。 |
4。 | 準(zhǔn)備兩倍的系列稀釋液以獲得STD6至STD2。用移液管吸取50 µl重新配制的STOCK STD = STD7到標(biāo)有STD6的管中。*混合。繼續(xù)對(duì)STD5，STD4，STD3，STD2進(jìn)行系列稀釋（見(jiàn)圖1）。 |
5， | ASYBUF用作零標(biāo)準(zhǔn)品（= STD1，0 pmol / l）。 |
準(zhǔn)備STD7至STD1
將樣品置于室溫并輕輕混合樣品，以確保樣品均勻。我們建議對(duì)所有樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。
值高于STD7（200 pmol / l）的樣品可用ASYBUF（測(cè)定緩沖液）稀釋。
鼠標(biāo)樣本
小鼠血清，血漿和尿液樣品必須用分析緩沖液（ASYBUF）稀釋1 + 7。5 µl樣品+ 35 µl ASYBUF。稀釋后的樣品在4°C（2-8°C）下穩(wěn)定過(guò)夜。因此可以在分析前一天制備稀釋液。
大鼠樣本
大鼠樣品未經(jīng)稀釋即使用。
在開(kāi)始測(cè)定之前，請(qǐng)閱讀整個(gè)方案。
1。 | 使樣品和試劑達(dá)到室溫（18-26°C）。 |
2。 | 在協(xié)議表上標(biāo)記STD / CTRL / SAMPLE（標(biāo)準(zhǔn)/對(duì)照/樣品）的位置。 |
3。 | 從鋁袋中取出微量滴定條。將未使用的干燥劑帶在4°C的鋁袋中存放。膠條在標(biāo)簽上標(biāo)明的有效期限之前都是穩(wěn)定的。 |
4。 | 移取50 µl ASYBUF（測(cè)定緩沖液，天然蓋）到每個(gè)孔中。 |
5， | 將5 µl STD / CTRL / SAMPLE加到各自的孔中，一式兩份。 |
6。 | 在每個(gè)孔中加入50 µl CONJ（結(jié)合物，琥珀色帽）。輕輕旋轉(zhuǎn)。 |
7。 | 蓋緊板，輕輕旋轉(zhuǎn)并在室溫（18-24°C）下孵育4小時(shí)。 |
8。 | 用300 µl稀釋的WASHBUF（洗滌緩沖液）抽吸并洗孔5次。后一次洗滌后，用一塊毛巾強(qiáng)力拍打盤子，以除去剩余的WASHBUF。 |
12 | 在每個(gè)孔中加入100 µl SUB（底物，藍(lán)色蓋）。 |
13 | 在黑暗中于室溫下孵育30分鐘。 |
14。 | 在每個(gè)孔中加入50 µl STOP（終止溶液，白色蓋）。 |
15 | 如果可用，立即在參考630 nm的450 nm處測(cè)量吸光度。 |
使用450 nm波長(zhǎng)（參考波長(zhǎng)630 nm）在讀板器上讀取所有孔的光密度（OD）。使用能夠生成四參數(shù)對(duì)數(shù)（4-PL）擬合的市售軟件從標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度讀數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘撸瑢?biāo)樣在x軸上的濃度相對(duì)于每種標(biāo)樣在y軸上的平均吸光度作圖，并通過(guò)圖中的點(diǎn)繪制擬合曲線。除4-PL以外的曲線擬合算法尚未得到驗(yàn)證，用戶需要對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。
從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品濃度。如果需要，可通過(guò)應(yīng)用轉(zhuǎn)換因子將pmol / l轉(zhuǎn)換為pg / ml（1 ng / ml = 18.87 pmol / l； Vanin-1小鼠/大鼠MW：53 kDa）。
計(jì)算樣品的終濃度時(shí)，必須考慮各自的稀釋系數(shù)。
Vanin-1是由513個(gè)氨基酸組成的GPI固定糖蛋白，由一個(gè)堿基結(jié)構(gòu)域和一個(gè)酶促腈水解酶結(jié)構(gòu)域組成（Boersma等，2014）。外切酶催化泛酸水解為泛酸（維生素B5）和胞嘧啶，因此參與氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)節(jié)（Maras等，1999）。Vanin-1具有廣泛的組織表達(dá)，在腎小管上皮細(xì)胞中觀察到高水平（Pitari等人，2000）.Vanin-1的GPI錨可以通過(guò)未知的機(jī)制裂解，從而導(dǎo)致Vanin-1被掉進(jìn)細(xì)胞外空間。
分子量 | 52.07 kDa |
細(xì)胞定位 | 細(xì)胞外質(zhì)膜 |
翻譯后修飾 | 糖基化，脂化（GPI錨） |
序列相似性 | Vanin蛋白家族的成員，與生物素酶家族的序列相似性 |
替代名稱 | 血管非炎性分子1，Tiff66，泛酸水解酶，泛酸酶，VNN1，HDLCQ8 |
Entrez / NCBI ID | 8876 |
基因卡 | GC06M132680 |
OMIM | 603570 |
蛋白質(zhì)圖譜 | VNN1 |
Uniprot ID | O95497 |
Vanin-1是一種上皮細(xì)胞外酶，可激活泛素向泛酸（維生素B5）和半胱胺的轉(zhuǎn)化（Pitari等，2000）。已有研究表明Vanin-1釋放的半胱胺可通過(guò)抑制超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化劑的活性來(lái)促進(jìn)氧化性組織損傷和炎癥（Hosohata等，2011; Saghaei等，2012 ）。實(shí)際上，Vanin-1基因敲除小鼠的GSH儲(chǔ)存量較高，并且對(duì)全身伽馬射線輻射引起的氧化損傷具有更高的抵抗力（Berruyer等，2004）。另一方面，一些報(bào)告表明Vanin-1也可能充當(dāng)氧化應(yīng)激的組織傳感器。在小鼠中，可以在Vanin-1的啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出類似抗氧化劑反應(yīng)的元素，它們?cè)诖嬖谘趸瘧?yīng)激的情況下增強(qiáng)Vanin-1的表達(dá)（Berruyer等，2004）。同樣，在人類近端腎小管細(xì)胞系中，暴露于有機(jī)溶劑后，Vanin-1的表達(dá)也被上調(diào)（Hosohata等，2011）。在大鼠腎臟缺血-再灌注后，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)涉及氧化組織損傷的模型，腎臟Vanin-1的表達(dá)也被上調(diào)（Yoshida等，2002）。
Vanin-1表達(dá)的高水平可能歸因于腎小管上皮細(xì)胞，而腎小球中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)（Hosohata等，2011； Pitari等，2000）。因此，從腎細(xì)胞釋放的Vanin-1可以在尿液中檢測(cè)到。在一項(xiàng)旨在鑒定腎小管損傷的生物標(biāo)記物的研究中，Hosohata及其同事確實(shí)可以在腎毒性藥物誘發(fā)的大鼠模型中證明，Vanin-1在腎小管中的表達(dá)要比其他標(biāo)記物早，并掉入尿液中（Hosohata等， 2011）。隨后的研究進(jìn)一步證實(shí)了Vanin-1作為藥物引起的急性腎損傷（Hosohata等，2012，2016a），阻塞性腎?。╓ashino等，2019）和腎積水（Hosohata）的早期腎小管損傷的生物標(biāo)志物的有效性。等（2018），糖尿病腎病（Fugmann等，2011），高鹽攝入下實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎（Hosohata等，2014）和自發(fā)性高血壓大鼠的腎臟損傷（Hosohata等，2016b; Washino等，2018）。值得注意的是，Vanin-1似乎比已建立的標(biāo)志物KIM-1，NGAL或NAG具有更好的預(yù)測(cè)急性腎損傷的價(jià)值（Fugmann等，2011； Hosohata，2016； Hosohata等，2011）。
腎臟科
Vanin-1-/-小鼠表現(xiàn)出谷胱甘肽介導(dǎo)的組織對(duì)氧化應(yīng)激的抗性。
Berruyer，C.，Martin，F(xiàn)M，Castellano，R.，Macone，A.，Malergue，F(xiàn).，Garrido-Urbani，S.，Millet，V.，Imbert，J.，Duprè，S.，Pitari，G. ，Naquet，P.，Galland，F(xiàn).，2004 。細(xì)胞。生物學(xué) 24，7214–7224。
PMID：15282320; PMCID：PMC479710
Vanin 1的結(jié)構(gòu)：連接代謝疾病和炎癥的關(guān)鍵酶。
Boersma，YL，Newman，J.，Adams，TE，Cowieson，N.，Krippner，G.，Bozaoglu，K.，Peat，TS，2014。ActaCrystallogr 。D生物學(xué)。Crystallogr。70，3320–3329。
PMID：25478849
在1型糖尿病腎病大鼠模型中，vanin-1的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定為腎臟損傷的標(biāo)志物。
Fugmann，T.，Borgia，B.，Révész，C.，Godó，M.，F(xiàn)orsblom，C.，Hamar，P.，Holthöfer，H.，Neri，D.，Roesli，C.，2011.腎臟。80，272–281。
PMID：21544065
腎盂尿液中的Vanin-1反映了腎積水大鼠模型的腎臟損傷。
Hosohata，K.，Jin，D.，Takai，S.，Iwanaga，K.，2018.分子科學(xué)19。
PMID：30332759; PMCID：PMC6214032
氧化應(yīng)激在藥物誘發(fā)的腎損傷中的作用。
Hosohata，K.，2016年。分子科學(xué)17。
PMID：27809280; PMCID：PMC5133827
尿vanin-1對(duì)尿路上皮癌患者順鉑誘導(dǎo)的腎毒性的早期預(yù)測(cè)。
Hosohata，K.，Washino，S.，Kubo，T.，Natsui，S.，F(xiàn)ujisaki，A.，Kurokawa，S.，Ando，H.Fujimura，A.，Morita，T.，2016a。毒理學(xué)359–360，71–75。
PMID：27317936
高鹽攝入量的自發(fā)性高血壓大鼠小管損傷的早期尿液生物標(biāo)志物。
Hosohata，K.，Yoshioka，D.，Tanaka，A.，Ando，H.，F(xiàn)ujimura，A.，2016年b。高血壓。Res。39，19–26。
PMID：26376947
實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠中使用尿vanin-1早期發(fā)現(xiàn)腎臟損傷。
Hosohata，K.，Ando，H.，F(xiàn)ujimura，A.，2014?！?em>應(yīng)用毒理學(xué)雜志》 34，184–190 。
PMID：23307618
尿Vanin-1作為藥物誘導(dǎo)的急性腎損傷的早期檢測(cè)的新型生物標(biāo)志物。
Hosohata，K.，Ando，H.，F(xiàn)ujimura，A.，2012年。《藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志》 341，656–662。
Vanin-1：腎毒性劑引起的腎損傷的潛在生物標(biāo)志物。
Hosohata，K.，Ando，H.，藤原，Y。，藤村，A.，2011。毒理學(xué)290，82–88。
PMID：21907259
Pantetheinase是小鼠和人類vanin-1蛋白的真實(shí)身份嗎？
Maras，B.，Barra，D.，Duprè，S.，Pitari，G. ，1999。FEBS來(lái)信461，149-152。
膜結(jié)合Vanin-1的Pantetheinase活性：Vanin-1缺陷小鼠組織中缺乏游離半胱胺。
Pitari，G.，Malergue，F(xiàn).，Martin，F(xiàn).，Philippe，JM，Massucci，MT，Chabret，C.，Maras，B.，Duprè，S.，Naquet，P.，Galland，F(xiàn).，2000。FEBS信函483，149–154。
卡托普利對(duì)半胱胺誘導(dǎo)的十二指腸潰瘍的影響。
Saghaei，F(xiàn).，Karimi，I.，Jouyban，A.，Samini，M.，2012。實(shí)驗(yàn)。Pathol。64，373–377。
PMID：21036019
Vanin-1，急性腎損傷的新型生物標(biāo)志物，用于阻塞性腎病：一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究。
華盛頓州北區(qū)野市，細(xì)田ata市，大島縣，小河內(nèi)市，小西區(qū)，中村市，佐藤市，宮川市，2019年。分子科學(xué)20。
PMID：30791405; PMCID：PMC6412925
正常血壓大鼠高鹽攝入量引起的腎小管損害的早期尿液生物標(biāo)志物。
Washino，S.，Hosohata，K.，Jin，D.，Takai，S.，Miyagawa，T.，2018.臨床。經(jīng)驗(yàn) Pharmacol。生理學(xué)。45，261–268。
PMID：29027259
監(jiān)測(cè)大鼠腎臟缺血再灌注中基因表達(dá)的變化。
吉田T.，庫(kù)雷拉M.，比托F.，Min H.，Ingelfinger，JR，Stears，RL，Swinford，RD，Gullans，SR，Tang，S.-S.，2002年。61，1646–1654.。
PMID：11967014
